Các đồng dạng akt1 và akt2 đóng vai trò khác biệt trong quá trình phát triển ung thư vú thông qua việc điều hòa các protein hạ lưu cụ thể | báo cáo khoa học

Các đồng dạng akt1 và akt2 đóng vai trò khác biệt trong quá trình phát triển ung thư vú thông qua việc điều hòa các protein hạ lưu cụ thể | báo cáo khoa học

Anonim

Đối tượng

  • Sinh học phân tử
  • Ung thư

trừu tượng

Mục đích của nghiên cứu này là làm sáng tỏ các cơ chế liên quan đến tác dụng cụ thể của các đồng dạng AKT1 và AKT2 trong tiến triển ung thư vú. Chúng tôi đã điều chỉnh sự phong phú của các đồng phân AKT cụ thể trong các dòng tế bào ung thư vú ở người IBH-6 và T47D và cho thấy AKT1 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào, thông qua quá trình tái cấu trúc S6 và cyclin D1, nhưng nó đã ức chế sự di chuyển của tế bào và sự xâm nhập của tế bào. FAK) điều chỉnh xuống. Ngược lại, AKT2 thúc đẩy di chuyển tế bào và xâm chiếm thông qua cảm ứng F-actin và vimentin. Do đó, trong khi sự biểu hiện quá mức của AKT1 đã thúc đẩy sự phát triển khối u cục bộ, sự điều hòa quá mức của AKT1 hoặc sự biểu hiện quá mức của AKT2 đã thúc đẩy sự xâm lấn màng bụng và di căn phổi. Hơn nữa, chúng tôi đã đánh giá bộ dữ liệu The Cancer Genome Atlas (TCGA) về ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn và thấy rằng tăng AKT2 nhưng không phải mức mRNA của AKT1 tương quan với kết quả lâm sàng tồi tệ hơn. Chúng tôi kết luận rằng các đồng dạng AKT đóng vai trò cụ thể trong các bước tiến triển khác nhau của ung thư vú, với AKT1 liên quan đến sự phát triển khối u cục bộ và AKT2 liên quan đến việc phổ biến khối u ở xa, có AKT2 có giá trị tiên lượng kém hơn và do đó là mục tiêu đáng để điều trị.

Giới thiệu

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ và là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên toàn thế giới. Mặc dù sự cải thiện trong chẩn đoán và những tiến bộ trong điều trị khối u, tử vong do ung thư là do phổ biến khối u 2 . Rối loạn trong tương tác tế bào-tế bào hoặc tế bào ngoại bào bình thường dẫn đến sự phá vỡ tính toàn vẹn màng tầng hầm và xâm lấn mô xung quanh, một bước trước trong tiến trình di căn 3 .

PI3K / AKT / mTOR là con đường được quy định phổ biến nhất trong phần lớn các khối u rắn bao gồm ung thư biểu mô tuyến vú 4, 5 . Nó đã được chứng minh rằng sự hoạt động quá mức của con đường góp phần vào sự hình thành khối u và sự phát triển khối u trong tuyến vú thông qua sự tăng sinh tế bào độc lập 6, xâm lấn tế bào 7, hủy bỏ tế bào nội tiết 8, 9 và kháng trị 10 . Nó đã được chứng minh rằng PIK3CA, AKT và PTEN có tỷ lệ đột biến tăng dẫn đến việc bãi bỏ quy định 11 . Tuy nhiên, cơ chế và tín hiệu hạ lưu mà PI3K và AKT điều chỉnh từng bước phát triển khối u và tiến triển ung thư vẫn chưa được hiểu rõ.

Trong các mô hình thử nghiệm, các đột biến PI3KCA đã được chứng minh là kích hoạt AKT hạ lưu và gây ra sự biến đổi gây ung thư 12, 13 do đó, các tổn thương này làm cho các khối u rất nhạy cảm với ức chế điều trị theo hướng PI3K / AKT / mTOR. Mặc dù số lượng lớn các thử nghiệm lâm sàng nhắm vào con đường ung thư, loại thuốc duy nhất được phê duyệt là Everolimus, một chất ức chế mTOR, kết hợp với Exemestane cho ung thư vú dương tính với thụ thể hoóc môn tiến triển (HR +) / HER2 âm tính (HER2−) tiến triển trên nội tiết trị liệu 14, 15 . Tuy nhiên, mối quan hệ giữa kích hoạt con đường hoặc đột biến PIK3CA và kết quả lâm sàng trong ung thư vú vẫn còn gây tranh cãi 16, 17, 18, 19 .

Có ba đồng dạng AKT; AKT1, AKT2 và AKT3, có chung tương đồng về cấu trúc và trình tự cao nhưng thể hiện các chức năng cụ thể và không dư thừa trong các loại khối u khác nhau 6, 20, 21, 22 . Ở vú, vai trò của AKT3 ít được nghiên cứu cho đến nay, nhưng dường như nó có vai trò ưu việt hơn trong ba khối u âm tính 23 . Liên quan đến các nghiên cứu AKT1 và AKT2, một số mô hình chuột biến đổi gen với ung thư biểu mô tuyến vú đã được phát triển và chúng cho thấy kết quả đa dạng. Trong một mô hình do ErbB2 gây ra, Hutchinson et al . 24 cho thấy kích hoạt AKT1 làm tăng tốc độ phát sinh khối u nhưng ngăn chặn sự xâm lấn của khối u, trong khi Ju et al . 25 đã báo cáo một vai trò tăng sinh và ủng hộ cho AKT1. Trong các mô hình MMTV-ErbB2 / neu và MMTV-PyMTV, Maroulakou et al . 26 báo cáo rằng cắt bỏ AKT1 làm chậm sự hình thành khối u, nhưng không có tác dụng đối với sự di căn, trong khi cắt bỏ AKT2 giúp tăng cường phát triển khối u tuyến vú. Ngược lại, trong mô hình MTB-IGF-IR Watson et al . 27 báo cáo rằng việc cắt bỏ AKT1 hoặc AKT2 làm trì hoãn sự khởi phát của khối u vú và ngăn chặn sự phát triển của khối u.

Trong các tế bào ung thư vú ở chuột và người, nhóm của chúng tôi đã mô tả rằng sự hoạt động quá mức của AKT1 dẫn đến sự phát triển khối u giống như ống 9 và kích hoạt các thụ thể nội tiết độc lập 8, 28 . Các nghiên cứu khác cho thấy rằng trong khi AKT1 ức chế di chuyển tế bào theo quy định ERK 29 hoặc do sự xuống cấp của NFAT 30, thì AKT2 thúc đẩy sự xâm lấn tế bào thông qua β1-integrin 31 và tái cấu trúc palladin 32 . Những nghiên cứu này và các nghiên cứu khác 33, 34 đã đưa ra giả thuyết rằng sự ức chế AKT1 có thể dẫn đến tăng cường xâm lấn tế bào khối u và bệnh di căn. Tuy nhiên, không có mô hình ung thư vú ở người nào được đề cập ở trên phân biệt hoàn toàn vai trò cụ thể của AKT1 và AKT2 đối với kiểu hình hung dữ và tiến triển bệnh trong cơ thể . Nghiên cứu hiện tại được thiết kế để phân tích vai trò và tín hiệu cụ thể của AKT1 và AKT2 trong việc điều chỉnh các giai đoạn tiến triển khác nhau của ung thư vú ở hai dòng tế bào ung thư vú ở người phát triển trong nuôi cấy và xenograft.

Các kết quả

AKT1, nhưng không phải AKT2, thúc đẩy sự tăng sinh tế bào

Nó đã được chứng minh rằng sự hoạt động quá mức của AKT1 dẫn đến tăng trưởng khối u tuyến vú tăng 9, 20, 25, 28 . Trong nghiên cứu này, các tế bào ung thư IBH-6 và T47D dương tính với thụ thể estrogen và progesterone (ER + / PR +) đã được sửa đổi ổn định để điều chỉnh hoặc điều hòa các đồng vị đặc biệt của AKT1 hoặc AKT2 và tìm kiếm các tác động cụ thể của chúng đối với sự tăng sinh, xâm lấn và xâm lấn của tế bào.

Sự hoạt động quá mức của AKT1 (myrAKT1) hoặc AKT2 (myrAKT2) đã được tạo ra với trình tự myristoylation, duy trì protein hoạt động cấu thành tại màng tế bào. Điều chỉnh giảm của AKT1 (shAKT1) hoặc AKT2 (shAKT2) đã được tạo ra với các cấu trúc shRNA. Việc điều chế các isoforms cụ thể đã được chứng thực bằng cách đánh giá biểu hiện protein (Hình 1a và b và Hình bổ sung S1a, b và c) và phosphoryl hóa (Hình 1c và d và Hình bổ sung. 1d). Chúng tôi không thể phân biệt quy định đặc trưng của isoform trong quá trình phosphoryl hóa pSer473AKT (Hình 1c và d) và pThr308AKT (Hình bổ sung. 1d) điều gì sẽ chỉ ra sự kích hoạt khác biệt, bởi vì các kháng thể này không phân biệt giữa các đồng vị AKT.

Image

( ab ) WB hiển thị lần lượt lên AKT1 hoặc AKT2 (trái) và điều hòa giảm (phải) trong các ô myrAKT và shAKT, tương ứng. ( c, bên trái ) WB và ( d ) IF màu xanh lá cây cho thấy mức pSer473AKT giảm trong các tế bào IBH-6 thiếu AKT1 và AKT2. ( c, phải) WB hiển thị mức pSer473AKT giảm trong các tế bào T47D thiếu AKT1 và AKT2. Kháng thể cho pSer473AKT nhận ra tất cả các đồng phân AKT được phosphoryl hóa trong Ser473. ( ef ) Tăng sinh tế bào trong các tế bào biểu hiện quá mức AKT (trái) hoặc -deficient (phải). ( g ) WB (trái) và định lượng (phải) cho cyclin D1 trong các tế bào thiếu IBH-6 AKT. (H) IF màu xanh lục cho pSer240S6 (pS6, bảng trên) và tổng S6 (bảng dưới) trong các ô thiếu IBH-6 AKT. Các hạt nhân được chống lại màu đỏ với PI. ERK1 / 2 hoặc α-Tubulin được sử dụng làm điều khiển tải. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001 so với các ô điều khiển hoặc shco. n = 3 (ANOVA, bài kiểm tra sau của Dunnet). Các đốm trong a, b, cg bị cắt. Blots chiều dài đầy đủ được trình bày trong Hình bổ sung S6.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Sau đó chúng tôi đã phân tích ảnh hưởng của điều chế AKT đến sự tăng sinh tế bào. Như mong đợi, trong cả hai dòng tế bào, sự biểu hiện quá mức của AKT1 đều tăng lên, trong khi đó sự điều hòa giảm của nó làm giảm sự tăng sinh tế bào. Tuy nhiên, ảnh hưởng của AKT2 đối với sự phát triển của tế bào chưa rõ ràng (Hình 1e và f). Sự điều hòa giảm có ý nghĩa thống kê về sự tăng sinh tế bào chỉ được quan sát thấy trong các tế bào IBH-6 shAKT2 (Hình 1e, bên phải). Hơn nữa, sự ức chế tăng sinh tế bào trong các tế bào IBH-6 shAKT1 đi kèm với điều hòa giảm cyclin D1 (Hình 1g) và giảm biểu hiện S6 và phosphoryl hóa (Hình 1h). Tuy nhiên, AKT2 không có tác dụng đối với quy định cyclin D1 hoặc S6. Kết quả tương tự đã được quan sát trong các tế bào T47D (Hình bổ sung. 1e và f). Những kết quả này chỉ ra rằng trong các tế bào IBH-6 và T47D, AKT1, nhưng không phải AKT2, kiểm soát sự tăng sinh tế bào thông qua quy định S6 và cyclin D1.

AKT1 và AKT2 đóng vai trò khác nhau trong việc di chuyển và xâm chiếm tế bào

Chúng tôi đã phân tích ảnh hưởng của điều hòa AKT cụ thể lên sự xâm lấn của tế bào. Các tế bào biểu mô IBH-6 hiển thị hình thái trục chính 35 . Trong nuôi cấy đơn lớp (hai chiều, 2D), các tế bào IBH-6 shAKT1 và IBH-6 shAKT2 được bảo tồn kích thước và hình thái so với các tế bào shco IBH-6 (Hình bổ sung S2a). T47D shAKT1 và T47D shAKT2 cũng được bảo tồn kích thước và hình thái ở dạng 2D (không hiển thị).

Trên màng tầng hầm ba chiều (3D) Matrigel, các tế bào shco IBH-6 được tổng hợp ở trên cùng, với một số tế bào xâm chiếm Matrigel (Hình bổ sung S2b). Quá trình điều hòa của AKT1 làm tăng kiểu hình xâm lấn, trong khi quá trình điều hòa của AKT2 đã loại bỏ kiểu hình này và các tế bào vẫn ở dạng tổng hợp (Hình bổ sung S2b). Một cách nhất quán, trong một thử nghiệm chữa lành vết thương, các tế bào shAKT1 có khả năng di chuyển tương tự như các tế bào shco IBH-6, trong khi các tế bào shAKT2 làm giảm nó (Hình 2a). Hơn nữa, shAKT1 tăng lên và shAKT2 làm giảm khả năng xâm chiếm Matrigel (Hình 2b). Hiệu ứng khác biệt của AKT1 và AKT2 trên kiểu hình xâm lấn ít rõ ràng hơn trong các tế bào T47D (không hiển thị).

Image

( a ) Xét nghiệm chữa lành vết thương. Hình ảnh đại diện tại T0 và Tf (21 giờ sau) của một thí nghiệm (trái). Biểu đồ thanh đại diện cho việc định lượng khu vực di chuyển (phải). ( b ) Xét nghiệm xâm lược Transwell (trái). Biểu đồ thanh biểu thị mức trung bình của các ô đã xâm chiếm Matrigel và được gắn ở phía bên kia của phần chèn sau 26 giờ (phải). ( ce ) NẾU cho β1-integrin và pTyr861FAK (pFAK). ( df ) Đại diện WB (trái) và định lượng (phải) của β1-integrin và pFAK. ( g ) NẾU phalloidin nhuộm màu trong các sợi F-actin màu đỏ (trái) và định lượng cường độ F-actin (phải). ( h ) IF cho vimentin (trái) và định lượng nhuộm vimentin (phải). Các hạt nhân được thay thế bằng màu đỏ với PI (trừ g ). Mũi tên trắng hiển thị nội địa hóa dấu chấm câu ( ce ) và sợi actin ( g ). * P <0, 05; ** p <0, 01. n = 3. Các đốm trong df bị cắt. Các blots chiều dài đầy đủ được trình bày trong Hình S7 bổ sung.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Sau đó, chúng tôi đã phân tích ảnh hưởng của im lặng đồng dạng kép (shAKT1 / 2). Đối với điều này, các tế bào IBH-6 đã được đồng nhiễm để điều hòa đồng thời AKT1 và AKT2 (Hình bổ sung S3a). Các tế bào ShAKT1 / 2 giảm sự tăng sinh (Hình bổ sung S3b), tương tự như các tế bào shAKT1. Hơn nữa, hiệu ứng của shAKT1 chiếm ưu thế so với hiệu ứng của shAKT2 và kiểu hình kết quả là sự gia tăng di chuyển (Hình bổ sung S3c) và khả năng xâm lấn (Hình bổ sung S3d) của các tế bào IBH-6 shAKT1 / 2. Những kết quả này chứng minh rằng AKT1 ức chế sự di chuyển và xâm chiếm tế bào, và tác dụng của nó là phổ biến so với AKT2.

AKT1 và AKT2 trái ngược với sự điều hòa của protein bám và tế bào xâm lấn

Các integrins thuộc về một họ các thụ thể màng tế bào tham gia vào các tương tác ma trận tế bào ngoại bào thông qua các protein kinase, và trong việc điều chỉnh hoạt động và nội địa hóa của protein nội bào và ngoại bào để phổ biến tế bào 36, 37 .

Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng sự hoạt động quá mức của biểu hiện kinase tiêu điểm điều hòa AKT1 (FAK), dẫn đến giảm độ bám dính tế bào IBH-6 9 . Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tích mức độ integ1-integrin và FAK sau khi điều chỉnh lại AKT1 hoặc AKT2. β1-integrin tăng trong các ô shAKT1 (Hình 2c và d). Một cách nhất quán, sự phosphoryl hóa FAK (pFAK) tăng lên trong các tế bào shAKT1 và không thay đổi trong các tế bào shAKT2 (Hình 2e và f). MMP9 cũng được tăng lên trong các ô shAKT1 (không hiển thị). Hơn nữa, trong các tế bào shAKT1, β1-integrin và pFAK đặc biệt tăng gần các cạnh màng trong một địa phương có dấu chấm câu (Hình 2c và e).

Chúng tôi cũng đã phân tích các thành phần cytoskeleton F-actin và vimentin, thường được quy định trong quá trình di chuyển tế bào. Trong khi các tế bào IBH-6 shAKT1 biểu thị mức F-actin tương tự như các tế bào shco, với các sợi actin được xác định rõ ràng, các tế bào IBH-6 shAKT2 thể hiện một kiểu biểu hiện yếu hơn, với các sợi không xác định (Hình 2g). Hơn nữa, trong khi các tế bào shco IBH-6 biểu thị mức độ cao của vimentin, thì shAKT1 làm giảm mức độ của protein này với một mẫu phân cực (Hình 2h). Các tế bào ShAKT2 cũng làm giảm mức độ của vimentin, mặc dù với kiểu không phân cực, phù hợp với khả năng giảm khả năng xâm chiếm Matrigel của chúng (Hình 2h). Mặc dù, sự biểu hiện quá mức của AKT1 và AKT2 không làm thay đổi hình thái tế bào trong 2D (Hình bổ sung S4a), các tế bào myrAKT1 đã giảm mức độ và phân cực của pFAK (Hình bổ sung S4b), trong khi các tế bào myrAKT2 tăng phản ứng trùng hợp F-actin (Hình bổ sung). Các ô .Wild loại (WT) thể hiện một hành vi tương tự như các ô được điều khiển ACL-4.1 hoặc pCDNA3 (không hiển thị). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy rằng sự xâm chiếm tế bào được quy định khác nhau bởi AKT1 và AKT2 thông qua các hiệu ứng xuôi dòng của chúng. Đó là, trong khi các protein bám dính tế bào β1-integrin và FAK được ưu tiên ức chế bởi AKT1, các thành phần cytoskeleton F-actin và vimentin được ưu tiên tạo ra bởi AKT2.

AKT1 và AKT2 tạo ra các kiểu hình ung thư vú khác nhau trong xenogcraft

Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng các tế bào IBH-6 myrAKT1 được tiêm vào động vật bị ức chế miễn dịch đã tạo ra các khối u phát triển nhanh hơn các tế bào IBH6 ACL-4.1 9 . Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng các tế bào IBH-6 shAKT1 có nguồn gốc các khối u nhỏ hơn với tốc độ tăng trưởng thấp hơn so với các tế bào shco IBH-6 (Hình 3a). Ngược lại, các tế bào IBH-6 shAKT2 không thay đổi độ trễ hoặc tốc độ tăng trưởng của khối u. Điều đáng nói là các tế bào IBH-6 shco đã tạo ra các khối u phát triển tương tự như các tế bào IBH-6 WT 38 và tất cả các dòng tế bào có nguồn gốc IBH-6 đều phát triển trong trường hợp không cung cấp hormone ngoại sinh. Do các khối u IBH-6 shco và shAKT2 phát triển quá nhanh, khi chúng đạt kích thước tối đa cho phép theo hướng dẫn của NIH và 39, các động vật đã bị hy sinh, và các khối u, phổi và gan đã được loại bỏ để phân tích mô học và sự hiện diện của di căn.

Image

( a ) Đường cong tăng trưởng của các tế bào thiếu IBH-6 shco và AKT ở chuột NSG. ( b ) HE trong các mẫu khối u, mũi tên chỉ sự xâm lấn khối u của mô mỡ lân cận. Các khối u shco IBH-6 được phân biệt kém, tương tự như ung thư biểu mô IBH-6 WT, với hai quần thể tế bào được xác định rõ ràng: một biểu mô giống như biểu mô và hình trục chính khác (hình nhỏ). ( c ) nhuộm Ki67 và ( d ) β1-integrin. ( e ) HE trong phổi từ động vật mang khối u IBH-6 shAKT1, cho thấy thâm nhiễm tế bào đa hình (trái, được chỉ định bởi các mũi tên) và hai ổ di căn (phải) ở 6 trong số 12 động vật. *** p <0, 001. n = 4 trong mỗi nhóm thử nghiệm cho các đường cong tăng trưởng khối u. Các thí nghiệm đã được thực hiện bằng cách nhân đôi.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Mô học khối u cho thấy sự khác biệt có liên quan tùy thuộc vào sự điều hòa của AKT cụ thể được điều hòa (Hình 3b). Các khối u IBH-6 shAKT1 đã được làm giàu trong quần thể giống như nguyên bào sợi, hầu như không có tế bào biểu mô (Hình 3b, hình nhỏ). Hơn nữa, mặc dù tốc độ tăng trưởng giảm, các khối u shAKT1 hiển thị các dấu hiệu rõ ràng về sự xâm lấn của mô mỡ liền kề (Hình 3b, mũi tên). Ngược lại, các khối u IBH-6 shAKT2 hiển thị hình thái ít trục chính hơn, không có dấu hiệu xâm lấn (Hình 3b). Chúng tôi đã phân tích bằng IHC biểu hiện của AKT1 và AKT2 trong các khối u thiếu shco và AKT (Hình bổ sung. S5a và b) để xác nhận việc điều chỉnh lại AKT cụ thể. Các khối u ShAKT1 hiển thị ít tế bào dương tính Ki67 hơn (Hình 3c) bao gồm tỷ lệ tăng sinh giảm (Hình 3a). Cuối cùng, mức độ integ1-integrin trong các khối u đã tái tạo các kết quả thu được trong nuôi cấy tế bào; nghĩa là, tăng mức độ trong shAKT1 và giảm mức độ trong các khối u shAKT2, so với các khối u shco (Hình 3d).

Vào cuối thí nghiệm, 40 ngày sau khi cấy tế bào, không có sự di căn nào được tìm thấy trong bất kỳ nhóm thử nghiệm nào (không được hiển thị). Tuy nhiên, phổi từ động vật mang khối u shAKT1 có dấu hiệu viêm, chẳng hạn như thâm nhiễm tế bào đa hình (Hình 3e, bên trái), cho thấy một hốc di căn thuận lợi cho các tế bào lưu thông. Các thí nghiệm dài hạn (60 ngày sau khi cấy tế bào) với các tế bào IBH-6 shAKT1 đã tạo ra sự di căn phổi (Hình 3e, phải). Các thí nghiệm dài hạn không thể thực hiện được ở động vật mang khối u shco hoặc shAKT2 vì những lo ngại về phúc lợi động vật.

Tương tự, trong xen kẽ T47D, im lặng AKT1 làm giảm sự phát triển của khối u, trong khi im lặng AKT2 không làm thay đổi tốc độ tăng trưởng so với các khối u kiểm soát (Hình 4a). Mặc dù các khối u T47D shAKT1 có kích thước nhỏ hơn, là những khối duy nhất có dấu hiệu xâm lấn rõ ràng, với các nhóm tế bào xâm lấn mô mỡ liền kề (Hình 4b, mũi tên). AKT điều hòa giảm đặc hiệu isoform đã được xác nhận bởi IHC (Hình bổ sung. S5c và d). Các khối u T47D shAKT1 biểu hiện mức độ thấp của E-cadherin và mức độ cao của vimentin, có thể là khúc dạo đầu của một kiểu hình thân, trong khi các khối u shAKT2 cho thấy mô hình ngược lại, E-cadherin cao và vimentin thấp (Hình 4c). Không có mối quan hệ di căn nào được quan sát tại thời điểm hiến tế ở bất kỳ động vật nào có các đồng phân im lặng (không hiển thị).

Image

Đường cong tăng trưởng của ( a ) T47D shco và các tế bào thiếu AKT hoặc ( d ) T47D WT và các tế bào biểu hiện quá mức AKT ở chuột NSG. ( be ) HE trong các mẫu khối u, mũi tên chỉ sự xâm lấn khối u của mô mỡ hoặc mô cơ lân cận. ( c ) Nhuộm E-cadherin và vimentin trong các khối u thiếu T47D và AKT. ( f ) HE trong phổi của động vật mang khối u T47D myrAKT2 cho thấy di căn tập trung ở 8 trên 12 động vật. ( g ) IHQ cho pan-cytokeratin nhuộm các tế bào di căn biểu mô trong phổi. ** p <0, 01; *** p <0, 001. n = 3 trong mỗi nhóm thử nghiệm cho các đường cong tăng trưởng khối u. Các thí nghiệm đã được thực hiện bằng cách nhân đôi.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Để xác nhận kết quả của hàm xâm lấn vi phân của các đồng phân AKT, chúng tôi đã thể hiện quá mức các đồng phân cụ thể. Xenograft T47D myrAKT1 hiển thị độ trễ khối u thấp hơn và tăng trưởng (Hình 4d), như đã thấy trước đây trong xenograft IBH-6 myrAKT1 9 . Tuy nhiên, sau 15 ngày, tốc độ tăng trưởng của khối u T47D myrAKT1 tương đương với khối u T47D WT (Hình 4d). Sự chậm lại về tốc độ tăng trưởng của các tế bào T47D myrAKT1 có thể là do các tế bào này vẫn phụ thuộc vào nguồn cung estradiol cho sự tăng trưởng. Các xenograft T47D myrAKT2 hiển thị tốc độ tăng trưởng tương tự như xenograft WT (Hình 4d), nhưng trên thực tế, chúng hiển thị mô học giống như các khối u thùy với sự xâm lấn của mô cơ lân cận (Hình 4e, mũi tên). Hơn nữa, các thí nghiệm dài hạn (60 ngày sau khi cấy tế bào) cho thấy các ổ di căn trong phổi của động vật mang khối u T47D myrAKT2 (Hình 4f) dương tính với cytoqueratin biểu mô tế bào biểu mô (Hình 4g). Điều đáng nói là T47D WT không phải là một dòng tế bào di căn.

Mức độ khối u AKT1 và AKT2 tương quan khác nhau với sự sống sót trong ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn

Cuối cùng, để đánh giá xem mức độ khối u AKT1 và AKT2 có liên quan đến tiến triển ung thư vú ở bệnh nhân hay không, chúng tôi đã đánh giá 1105 mẫu ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn có sẵn từ trang web The Cancer Genome Atlas (TCGA) 40, 41 bao gồm các bộ dữ liệu có khuếch đại DNA, đột biến, xóa và điều chỉnh tăng và giảm mRNA (Hình 5a). Chỉ xem xét cấu hình dữ liệu biểu hiện mRNA cho AKT1 và AKT2, chúng tôi thấy rằng AKT2 nhưng không phải AKT1 có liên quan đến tỷ lệ sống thấp hơn (Hình 5b).

Image

( a ) AKT1 (tỷ lệ thay đổi 11%) hoặc AKT2 (tỷ lệ thay đổi 10%) thay đổi di truyền trong 1105 mẫu ung thư biểu mô xâm lấn vú từ TCGA. Đối với AKT1 và đối với AKT2, sự thay đổi chủ yếu trong các mẫu bệnh nhân là sự điều hòa của mRNA. ( b ) Các đường cong Kaplan-Meier trong quần thể tham chiếu cho thấy sự điều hòa mRNA của AKT2 có liên quan đến khả năng sống sót tồi tệ hơn (p = 0, 0535) so với điều chỉnh lại mRNA của AKT1 (p = 0, 935).

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Nhìn chung, những phát hiện của chúng tôi từ các mô hình thử nghiệm và phân tích tổng hợp TCGA hỗ trợ cho ý tưởng rằng sự tiến triển của khối u trong ung thư vú có sự khác biệt liên quan đến các đồng dạng AKT1 và AKT2. Tóm lại, mức AKT1 và AKT2 có thể được sử dụng như là dấu ấn sinh học của tiến triển ung thư vú trong quá trình chẩn đoán để phân biệt tập hợp bệnh nhân nào có thể tiến triển sớm hơn và do đó có kết quả lâm sàng tồi tệ hơn. Chúng tôi cung cấp bằng chứng thực nghiệm và lâm sàng rằng chủ yếu là biểu hiện quá mức AKT2 có liên quan đến tiến triển bệnh và có giá trị tiên lượng xấu hơn trong ung thư vú.

Thảo luận

Kết quả của chúng tôi cho thấy các đồng dạng AKT1 và AKT2 điều chỉnh các tế bào ung thư vú khác nhau. Ở đây chúng tôi mô tả các cơ chế mà AKT1 và AKT2 đóng vai trò cụ thể trong sự phát triển và phổ biến khối u trong các dòng tế bào người IBH-6 và T47D. Chúng tôi thấy rằng AKT1 có liên quan đến sự tăng sinh tế bào và sự sống sót thông qua việc tái cấu trúc S6 và cyclin D1. Cả AKT1 và AKT2 đều tham gia vào quá trình di chuyển và xâm chiếm tế bào, mặc dù mỗi đồng phân quy định khác nhau β1-integrin, FAK, E-cadherin, F-actin và vimentin (Hình 6a) và do đó có tác dụng ngược với kiểu hình hung hăng (Hình. 6b). Các chức năng tế bào đặc hiệu của AKT1- và AKT2 cũng có thể được đánh giá cao trong cấy ghép vivo và chúng tôi mô tả sự xâm lấn của các mô mỡ và mô cơ lân cận cũng như di căn phổi có nguồn gốc từ xenograft shAKT1 và myrAKT2.

Image

( a ) Tín hiệu cụ thể của AKT1 và AKT2 và quy định protein hạ lưu cụ thể. ( b ) Sơ đồ đại diện cho các chức năng cụ thể của AKT1 và AKT2 về sự phát triển của khối u và sự xâm lấn của khối u.

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Mặc dù số lượng nghiên cứu ngày càng tăng về vai trò của các đồng dạng AKT trong ung thư, vai trò cụ thể của chúng vẫn chưa được làm rõ, là loại tế bào kết quả và phụ thuộc vào bối cảnh. Điều này nhấn mạnh sự liên quan của việc hiểu tính đặc hiệu của từng đồng phân AKT trong quá trình phát triển ung thư để xác định rõ hơn giá trị tiên lượng của chúng. Hầu hết các nghiên cứu thử nghiệm cho đến nay đã sử dụng các biến thể AKT hiếu động, chẳng hạn như các đột biến nhắm mục tiêu màng, hoặc các chiến lược hạ gục như shRNA trong ống nghiệm . Với cách tiếp cận này, vai trò khác biệt của AKT1 là chất gây tăng trưởng và AKT2 là chất ức chế tăng trưởng và xâm lấn đã được xác định rõ trong các tế bào ung thư buồng trứng, cả trong khối u và môi trường vi mô 22 . Ở vú, hầu hết dữ liệu trong các mô hình chuột biến đổi gen đều đồng ý rằng AKT1 rất quan trọng trong việc gây ung thư vú trong khi AKT2 liên quan nhiều hơn đến việc phổ biến di căn 20, 26 .

Trong các tế bào ung thư vú và buồng trứng, sự di cư và xâm lấn của AKT2 có liên quan đến sự điều hòa của β1-integrin 31, tuy nhiên, trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt, cả AKT1 và AKT2 đều làm giảm sự di chuyển tế bào và xâm lấn qua 1-integrin 42 . Ở đây chúng tôi chỉ ra trong các tế bào IBH-6 rằng sự điều hòa giảm đặc hiệu của AKT1, nhưng không phải là AKT2, tăng biểu hiện integ1-integrin và phosphoryl hóa FAK ở các vùng màng có dấu chấm tương thích với các vị trí bám dính tiêu điểm. FAK có thể được xem xét lên và xuống của AKT trong việc điều chỉnh yếu tố tăng trưởng và sự vận động của tế bào được kích thích bằng integrin. Trước đây chúng tôi đã chỉ ra trong các tế bào IBH-6 rằng sự hoạt động quá mức của AKT1 đã giảm, trong khi sự biểu hiện quá mức của PTEN làm tăng mức FAK 9 . Ngược lại, trong các tế bào ung thư ruột kết của con người, Wang et al . 43 báo cáo rằng AKT1, nhưng không phải AKT2, liên kết trực tiếp và phosphoryl hóa FAK. Hơn nữa, ở đây chúng tôi đã cho thấy sự tham gia của AKT2, nhưng không phải là AKT1, trong việc tu sửa lại tế bào actin cytoskeleton, cũng có liên quan đến việc di chuyển tế bào ung thư. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi xác nhận rằng AKT2 có vai trò tiên lượng trong các tế bào ung thư vú.

Một số nghiên cứu đã coi E-cadherin là gen ức chế khối u, cho thấy biểu hiện giảm của nó là một yêu cầu cho sự tiến triển của khối u. Sự biểu hiện quá mức của AKT1 trong các tế bào MCF10A được phát triển trong Matrigel 3D và được tiêm vào ống dẫn động của động vật có vú, giống như ung thư biểu mô ống trong các tổn thương giống như tại chỗ 44 . Tương tự, trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng AKT1 có liên quan đến sự biệt hóa ống trong nuôi cấy 3D và in vivo 9 và các tế bào ung thư vú myrAKT1 hình thành các cấu trúc giống như tổ chức và có biểu hiện E-cadherin cao. Ở đây chúng tôi chỉ ra rằng các khối u T47D thiếu AKT đặc hiệu hiển thị quy định nghịch đảo của E-cadherin và vimentin. Mặc dù mất E-cadherin, các khối u đủ AKT1 duy trì các tế bào xâm lấn gắn kết với mức độ vimentin cao hơn. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng rất có thể là sự cân bằng giữa các protein xâm lấn hơn là mức protein trong các tế bào riêng lẻ, yếu tố quyết định mức độ xâm lấn của khối u. Nhìn chung, chúng tôi suy đoán rằng AKT1 hoạt động như một chất ức chế xâm lấn trong giai đoạn đầu của bệnh, nhờ đó AKT2 tăng cường sự xâm lấn và xâm lấn của tế bào trong các giai đoạn tiến triển của bệnh (Hình 6b).

Cuối cùng, chúng tôi đã tìm thấy, trong một phân tích đơn biến về 1105 mẫu ung thư xâm lấn vú từ TCGA, bệnh nhân mang đột biến làm tăng mức độ mRNA của AKT1 có kết quả tốt hơn so với bệnh nhân bị đột biến ở mức độ AKT2, có thời gian sống sót ngắn hơn . Do đó, nghiên cứu của chúng tôi đề xuất rằng AKT2 tạo thành một dấu hiệu tiên lượng về kết quả lâm sàng kém trong ung thư vú. Kết luận này được hỗ trợ thêm bởi các cơ chế tế bào mà chúng tôi mô tả ở đây trong hai dòng tế bào ung thư vú ở người.

Các nghiên cứu gần đây có liên quan đến biểu hiện AKT với tiên lượng ung thư cho thấy một số kết quả trái ngược nhau tùy thuộc vào đặc điểm của dân số được đánh giá và phương pháp kỹ thuật 45, 46, 47 . Pereira và cộng sự . 47 chỉ ra rằng AKT2 có liên quan đến việc mua lại các đặc tính giống như tế bào gốc, chịu trách nhiệm cho sự xâm lấn và hóa trị và kết quả ung thư vú tồi tệ nhất. Tuy nhiên, Fohlin et al . 46 đã chứng minh rằng mức AKT2 và pAKT (pSer473AKT) có liên quan đến tỷ lệ tái phát xa hơn. Trong cùng một dòng, Grell et al . 45 cho thấy biểu hiện AKT2 và sự hiện diện đồng thời của pAKT (pThr308AKT và / hoặc pSer473AKT) liên quan đến kết quả tốt hơn ở bệnh nhân di căn HER2 + được điều trị bằng Trastuzumab. Hơn nữa, Badve et al . 48 thấy rằng nội địa hóa hạt nhân của pAKT (pSer473AKT) có liên quan đến sự sống sót lâu dài tốt hơn ở bệnh nhân ung thư vú ER + / PR +. Các nghiên cứu khác cho thấy AKT1 thúc đẩy sự tiến triển trong ung thư vú giai đoạn đầu, trong khi AKT2 đảo ngược hiệu ứng này 49, 50, 51 . Hơn nữa, Plant et al . 52 đã mô tả một sự xáo trộn trong AKT1 từ nhân đến tế bào chất trong quá trình phát triển khối u vú. Sự kiện này cũng có thể liên quan đến kích hoạt protein khác biệt trong mô khối u như chúng tôi báo cáo ở đây; tức là protein tăng sinh ở giai đoạn đầu và protein tái tạo ECM, như β1-integrin, trong giai đoạn nâng cao. Tất cả những bằng chứng khác nhau này khuyên rằng một đánh giá mạnh mẽ về AKT1 và AKT2 trong giai đoạn sớm và muộn của bệnh được đề xuất là dấu hiệu tiên lượng mới. Ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, biểu hiện AKT và phosphoryl hóa có liên quan đáng kể đến kết quả không thuận lợi, với biểu hiện AKT1 tế bào tương quan với nguy cơ tái phát sau phẫu thuật cao hơn 53 và mức pAKT dự đoán kết quả lâm sàng kém 4 .

Cuối cùng, những nỗ lực mổ xẻ các cơ chế phân tử của tín hiệu đặc hiệu AKT isoform sẽ cung cấp những hiểu biết mới để thiết kế phương pháp trị liệu hiệu quả và chọn lọc hơn trong điều trị ung thư 23, 54, 55, 56, 57 . Về vấn đề này, siRNA đặc hiệu isoform, microRNA, chất ức chế và kháng thể tạo thành công cụ để làm sáng tỏ sự đóng góp tương đối của mỗi tín hiệu đồng vị AKT và nội địa hóa để lây lan ung thư. Kết quả của chúng tôi trong các dòng tế bào ung thư vú cho thấy mặc dù im lặng kép AKT1 / AKT2 làm giảm sự tăng sinh tế bào, nhưng nó đáng ngạc nhiên giúp tăng cường di chuyển và xâm lấn tế bào. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng nhắm mục tiêu ở cấp PI3K hoặc AKT1 / 2 sẽ không hiệu quả trong việc ngăn chặn sự tiến triển của khối u, mặc dù việc nhắm mục tiêu cụ thể vào các tín hiệu do AKT2 điều khiển có thể hiệu quả hơn trong việc ngăn chặn sự xâm lấn của bệnh ung thư. Thách thức bây giờ là thử các liệu pháp đích mới hướng đến tín hiệu hạ lưu được kích hoạt AKT2 kết hợp với các thuốc nhắm mục tiêu PI3K và / hoặc mTOR để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc giảm tiến triển ung thư vú. Các chất ức chế PanAKT bao gồm MK2206, AZD5363 hiện đang được thử nghiệm lâm sàng đối với các khối u ác tính tiến triển như ung thư tuyến tụy, đại trực tràng, vú và tuyến tiền liệt. Các chất ức chế chọn lọc đối với các đồng phân AKT đã được phát triển và thử nghiệm tiền lâm sàng nhưng chưa đạt được các thử nghiệm lâm sàng (ví dụ CCT128930 với độ chọn lọc cao hơn đối với hoạt động của AKT2 và chống ung thư) 58 . Tác dụng của các chất này hoặc các chất ức chế AKT khác trong sự gây hấn của tế bào đáng được nghiên cứu thử nghiệm thêm trong bối cảnh dữ liệu hiện tại cho thấy các đồng dạng AKT có vai trò đặc biệt. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng sự gián đoạn cụ thể của AKT2 có thể tốt hơn là ức chế panAKT để điều trị ung thư vú tiến triển.

Phần kết luận

Những phát hiện của chúng tôi cung cấp một lý do để hướng dẫn việc sử dụng AKT1 và AKT2 như là dấu ấn sinh học của tiến triển bệnh và các mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp mới. Việc sử dụng chúng làm chỉ số tiên lượng làm nổi bật tầm quan trọng của việc đánh giá chính xác biểu hiện của các thành phần PI3K / AKT / mTOR nếu tín hiệu gây ung thư này được nhắm mục tiêu trong môi trường lâm sàng. Hơn nữa, việc xác định các thành phần hạ nguồn của tín hiệu AKT1 và AKT2 liên quan đến từng bước của bệnh sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện các liệu pháp điều trị bằng dấu ấn sinh học mới để trì hoãn hoặc ngăn chặn tiến triển.

Dựa trên các kết quả được hiển thị ở đây, dự đoán của chúng tôi là PI3K, panAKT hoặc ức chế AKT1 cụ thể có thể không được khuyến cáo, và thậm chí có thể chống chỉ định trong ung thư vú, vì nó có thể thúc đẩy sự xâm lấn khối u và phổ biến ung thư. Ngược lại, loại bỏ AKT2 hoặc các phân tử hạ lưu của nó có thể là một lựa chọn tốt hơn để cải thiện kết quả điều trị ung thư vú, ít nhất là đối với bệnh di căn.

Vật liệu và phương pháp

Các dòng tế bào và nuôi cấy

Dòng tế bào IBH-6 có nguồn gốc từ một phụ nữ 35 tuổi tiền mãn kinh 35, nó biểu hiện ER và PR và phát triển ở động vật NSG mà không cần cung cấp hormone 38 . Dòng tế bào người T47D yêu cầu tiêm 0, 25 mg 17β-estradiol trước đó để phát triển ở chuột NSG 28 .

Cả hai dòng tế bào được duy trì trong môi trường DMEM F12 (Sigma Aldrich St. Louis, MO) 10% huyết thanh bào thai (FBS, Natocor Córdoba Argentina). Đối với các tế bào nuôi cấy 3D, các tế bào được gieo hạt trên Matrigel (BD Bioscatics San Jose, CA).

Nghiên cứu trong ống nghiệm

Truyền và nhiễm trùng

Các dòng tế bào IBH-6 và T47D được chuyển đổi ổn định để thể hiện quá mức AKT1 (pACL4.1-myrAKT1 9 ) hoặc AKT2 (pCDNA3-myrAKT2, Addgene # 9016). Việc truyền máu được thực hiện với Thuốc thử Lipofectamine (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Việc xóa ổn định AKT1 hoặc AKT2 đã được thực hiện bằng cách sử dụng shRNA lentivirus cụ thể (TRCN0000022937 cho AKT1 hoặc TRCN0000055260 cho AKT2, Sigma). ShcNA không nhắm mục tiêu Shc-002 được sử dụng làm vector điều khiển. Đối với shRNA đặc hiệu chuẩn bị lentivirus đã được bảo vệ bằng pCMV-dR 8.74 plasmid và pMD2.G plasmid vào các tế bào HEK239T. Sau hai ngày, các hạt lentivirus đã được thu thập và các tế bào được tải nạp với sự có mặt của Polybrene (Sigma). Cells stably transfected were selected with 400 μg/ml Geneticin (G418, Invitrogen) or 5 μg/ml Puromicin (Calbiochem) according to selection gene in each case.

Xét nghiệm tăng sinh

4 × 10 4 cells were seeded and maintained during 4 days in DMEM F12 5% SFB medium (for IBH-6) or 5 days in DMEM F12 2% charcoal stripped FBS (chFBS) + 20 nM insulin (for T47D). Phương tiện đã được thay đổi mỗi ngày. At the end of the incubation cells were tripsinized and counted in Neubauer chamber.

Xét nghiệm chữa lành vết thương

5 × 10 5 cells were seeded 24 hours prior to the experiment. Wound was made with a tip and incubated for 21 hours in DMEM F12 5% FBS medium. Photographs were taken all along the wound at the beginning (T0) and at the end of the experiment (Tf). Wound healing areas were quantified as T0-Tf using the ImageJ software.

Transwell assay

5 × 10 4 cells were seeded on top of 8 μm transwell inserts (BD Biosciences) previously coated with 1:6 Matrigel: DMEM F12 medium and incubated for 26 hours. Cells were fixed with cold methanol, stained with Cristal Violet 0, 1% and the cells that passed through the insert were quantified.

Western blots (WB)

Total protein extracts were obtained using RIPA buffer (Sigma). 100 μg of protein from each sample was separated in 10% polyacrylamide electrophoresis gels. Phosphorylated protein's bands were normalized using total proteins, with the density of bands from the control group set arbitrarily to 1.0 using the ImageJ software.

Immunofluorescence (IF)

Cells were fixed with PFA 4%, blocked with PBS 10% FBS and incubated with primary antibodies overnight. After washing with PBS, cells were incubated with FITC or Dylight secondary antibodies (Vector Laboratories Burlingame, CA) and nuclei were counterstained with propidium iodide (PI) or 4′, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Stained cells were analyzed under a Nikon Eclipse E800 Laser Confocal Microscope.

PathScan Intracellular Signaling Array Kit

PathScan Intracellular Signaling Array Kit (Chemiluminescent Readout) #7323 (Cell Signaling Technology) was performed following manufacturer´s instructions for IBH-6 and T47D cell lines modified to overexpress or dowregulate AKT isoforms.

In vivo studies

Động vật

NOD/LtSz-scid/IL-2Rgamma null mice (NSG) from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) were bred at IByME Animal Facility and two-month-old virgin females were used for the experiments. Animal care and manipulation were performed in agreement with the International Guidelines and Regulations from the National Institute of Health. IByME's Ethical Committee approved the experiments and the use of animals for this work CE 023-June 2014.

Xenografts and immunohistochemistry (IHQ)

For IBH-6 xenografts, mice were injected subcutaneously with 5 × 10 6 cells. For T47D xenografts, mice were implanted subcutaneously with silastic pellets containing 17β-estradiol (0.25 mg) and injected subcutaneously with 8 × 10 6 cells mixed with Matrigel. When tumors were palpable, sizes were measured with caliper Vernier and growth curves were performed plotting tumor size (mm 2 ) vs. time.

Tumors, lungs, liver, uterus and ovaries were fixed in 10% formalin, paraffin embedded (FFPE) and sectioned into 5 μm for histochemical analysis. Tumor and tissue histology were evaluated in hematoxylin/eosin (H&E)-stained slides. For IHQ, FFPE tissues were stained for primary antibodies. Primary antiserum was detected after incubation with a biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories Inc.) using the Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories Inc.) and the diaminobenzidine (DAB) Chromogen and Substrate Buffer (Dako, Agilent Technologies). After IHC, the specimens were counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted.

TCGA analysis

Open data from 1105 breast invasive carcinoma samples from The Cancer Genome Atlas dataset (TCGA) 40, 41 and cbioportal platform (//www.cbioportal.org) were used to link AKT alterations to clinical outcomes. For the survival analysis we considered mRNA expression data profiles by RNA Seq for AKT1 and AKT2 and an arbitrary overexpression level greater than three standard deviations from the mean in the reference population.

Kháng thể

Total AKT1/2/3 (8312), phosphorylated Ser473AKT1/2/3 (7985), ERK1/2 (94), β1-integrin (8978), cyclin D1 (753) and actin (1616) were purchased from Santa Cruz Biotechnology; total AKT1 (2938), total AKT2 (3063), phosphorylated Ser240/244S6 (2215) and E-cadherin (3195) from Cell Signaling Technology, phosphorylated Tyr861FAK (4804) from Abcam, vimentin (V6630) from Sigma, alpha-tubulin (MS-719) from Neomarkers and cytokeratin Clones AE1/AE3 (M3515) from Dako.

Phân tích thống kê

Statistical analyses were performed with the GraphPad Prism™ software 6.0 (GraphPad, Inc. CA). One way ANOVA followed by Tukey or Dunnet´s post-tests was used to compare means of multiple experimental groups. When comparing the means of two different groups, two-sided Student's t -test was applied. Tumor growth curves were studied using regression analysis, and the slopes compared using analysis of variance. In all graphs, the mean ± SEM are shown.

thông tin thêm

How to cite this article : Riggio, M. et al . AKT1 and AKT2 isoforms play distinct roles during breast cancer progression through the regulation of specific downstream proteins. Khoa học Rep. 7, 44244; doi: 10.1038/srep44244 (2017).

Lưu ý của nhà xuất bản: Springer Nature vẫn trung lập liên quan đến khiếu nại tài phán trong các bản đồ được công bố và các chi nhánh tổ chức.

Thông tin bổ sung

Tập tin PDF

  1. 1.

    Tài liệu bổ trợ

Bình luận

Bằng cách gửi nhận xét, bạn đồng ý tuân theo Điều khoản và Nguyên tắc cộng đồng của chúng tôi. Nếu bạn thấy điều gì đó lạm dụng hoặc không tuân thủ các điều khoản hoặc nguyên tắc của chúng tôi, vui lòng gắn cờ là không phù hợp.